Etude dynamique et structurale de biomolécules par microscopie à force atomique HS-AFM (application à une petite protéine de choc thermique sHsp)

La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser la topographie d échantillons organiqueset inorganiques à l échelle atomique. Les innovations les plus récentes offrent désormais la possibilitéd accéder aux propriétés nano-mécaniques des échantillons (élasticité, adhésion ). Son panel defonctionnalités permet de pallier aux besoins des nanotechnologies, tant dans les domaines de laphysique, de la chimie que de la biologie.Cependant, les besoins nécessaires à la compréhension des processus biologiques imposent aumicroscope à force atomique des vitesses d acquisitions rapides, inférieures à la seconde par image. Leséquipements classiques n offrent pas cette possibilité. C est pour s affranchir de ce verrou technologique,pour l étude dynamique, qu un prototype de microscope à force atomique à haute-vitesse a étédéveloppé (HS-AFM) en partenariat avec l équipe du Professeur T. Ando à l Université de Kanazawa(Japon). Il permet d atteindre des vitesses de balayage identiques aux vitesses vidéos : 25-50 images/s, enmilieu liquide. Le dispositif est en perpétuelle amélioration : nouvelle boucle d asservissement, domainesde balayage augmentés. La haute résolution est, quant à elle, assurée par des leviers miniaturisés munisde sur-pointes en carbone. Parallèlement à l innovation du microscope en lui-même, des modulescomplémentaires ont été développés : module pousse seringue et module chauffant.Le potentiel de ce prototype, développé dans le cadre d un programme ANR PNANO 2008 HSnanobio-Imaging, a été montré via l étude d une petite protéine de choc thermique : la protéine sHspLo18. Cette protéine, issue de la bactérie lactique Oenococcus oeni, offrait la possibilité d étudier deschangements de degrés d oligomérisation en fonction du pH, ainsi que le rôle chaperon et lipochaperonen cas de stress environnemental d autres complexes biologiques. L utilisation des techniques demicroscopie couplée à des études biochimiques sur ce modèle protéique a permis d appréhender l effetdes surfaces sur l adsorption et la dynamique des complexes biologiques. L interaction protéine surfacea pu être approchée et s avère utile au développement des capteurs à protéinesThe atomic force microscopy (AFM) gives access to the topography of organic and inorganic samplesat the atomic scale. The latest innovations offer the possiblity to understand the sample nano-mechanicalproperties (elasticity, adhesion...). Its feature set allows overcoming the demands of nanotechnology,both in the fields of physics, chemistry and biology.However, understanding biological processes require faster acquisitions for the atomic forcemicroscopy, less than a second per frame. As conventional equipment does not offer the possibility toovercome the constraint of time for dynamical studies, a prototype of high-speed atomic forcemicroscope (HS-AFM) was developed in partnership with Professor T. Ando group of Kanazawa University(Japan). It can reach scanning video speed: 25-50 frames/s in a liquid medium. The device is beingconstantly improved: new feedback control, larger scanning sizes. The resolution is provided byminiaturized cantilevers with carbon EBD-tips. In parallel to innovative modules on the microscope, addonshave been developed: syringe pump and heating modules.The potential of the prototype, developed within the framework of the program ANR PNANO 2008HS-nanobio-Imaging, has been shown through the study of a small heat shock protein: the protein sHspLo18. This protein, from the lactic acid bacterium Oenococcus oeni, offered the possibility of a variouschanges of oligomerization degrees according to the pH, and also the chaperone and lipochaperon activityof protein under the influence of an environmental stress. The use of these techniques of microscopiescoupled with biochemical studies on this proteic model allowed to dread the effect of surfaces on theadsorption and the dynamics of biological complexes. The interaction protein surface coulb be toapprehend and proves to be useful for the development of protein sensors developed in the laboratoryDIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

High speed bio atomic force microscopy (application à l'étude de la structure et dynamique d'assemblage supramoléculaires)

Le microscope à force atomique (AFM) fait partie des microscopies de champ proche dites à sonde locale. De par sa versatilité, un grand nombre de domaines des nanosciences tant en physique, que chimie ou biologie utilisent cette technique. Cependant, le champ d investigation de la microscopie AFM classique est restreint temporellement et spatialement. En effet, en raison de sa limite de vitesse d acquisition d image et sa limite de caractérisation des interactions en surface, des études de dynamique moléculaire ou d éléments sub-surface ne sont pas envisageables. Nous montrons donc que la caractérisation en volume est permise en utilisant une méthode d imagerie non destructive, la microscopie de champ proche holographique ultrasonore (SNFUH). Cette méthode développée pour étudier à l.air et en liquide, a fourni des informations localisées en profondeur avec une haute résolution spatiale, en utilisant des fréquences de résonance dans la gamme du MHz. Une calibration a été effectuée sur des échantillons de structures enterrées ou non, réalisés par lithographie e-beam. Ces échantillons ont été utilisés pour ajuster les fréquences de résonance et comprendre la formation des images en mode acoustique (profondeur investiguée et inversion de contraste). Cet outil non invasif et innovant de caractérisation a donc été développé. Il présente un énorme potentiel pour des échantillons biologiques en termes de résolution et d information. Les microscopes AFMclassique et acoustique SNFUH sont soumis à des contraintes de temps. Pour s en affranchir, un prototype, le microscope à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) a été développé par l équipe du Professeur T. Ando à l Université de Kanazawa (Japon). Il autorise ainsi le balayage à vitesse vidéo, i.e. 25 images/s, en milieu liquide. Nous avons amélioré le prototype avec une nouvelle génération de boucle d asservissement et augmenté la zone de caractérisation. La résolution dépend fortement du levier utilisé. De plus une qualité d image supérieure est obtenue grâce à l utilisation de surpointes en carbone sur ces mêmes leviers. Finalement, nous montrons des résultats obtenus avec ces deux techniques de microscopies sur différents édi.ces biologiques en milieu liquide. Ainsi, avec le microscope AFM haute-vitesse, des dynamiques biomoléculaires ont pu être visualisées (ex : structures protéine-ADN) avec une résolution nanométrique. Puis une étude des changements conformationnels intracellulaires de kératinocytes vivantes dans leur milieu physiologique a été réalisée par microscopie acoustique SNFUH et montre la dégradation du matériel biologique. L ensemble de ces résultats ouvre un nouveau champ d investigation dans le domaine de la biologie.The atomic force microscope (AFM) made part of scanning near-field probe microscopy. Thanks to its versatility, many fields as physics, chemistry or biology use this technique. However, the field of investigation of the classical AFM microscope is limited temporally and spatially. Indeed, due to his scan speed limitation and surface interaction caracterisation limitation, studies of molecular dynamics and sub-surface elements are not possible. We show that the volume caracterisation is permitted using a non-destructive imaging method, called Scanning Near-Field by Ultrasound Holography (SNFUH). This tool developed for study in air and liquid has provided depth information as well as spatial resolution at the nanometer scale using resonant frequencies of about range of MHz. Calibration has been performed on samples of buried or not structures made by e-beam lithography and have been used to adjust the resonant frequency and understand the acoustic image formation (depth investigation and contrast in-version). We have developed a non-invasive and innovative tool of characterization for biology : he presents a huge potential for biological samples in terms of resolution and information. Classical AFM and acoustic SNFUH microscopes are time resolution limited. To overcome this time constraint, a prototype, High Speed Atomic Force Microscope (HS-AFM), has been developed by the team of Prof. T. Ando, Kanazawa University (Japan). It allows a scan rate at video speed, i.e. 25 frames/s, in liquid medium. We have improved the prototype, through a new generation of feedback control and increased the scan area. The resolution depends strongly of the probe used. Moreover a better image quality is obtained through the use of carbon tips on these cantilevers. Finally, we show our results obtained with these two microscopy techniques about biological buildings in liquid environment. Thereby, with the HS-AFM microscope, biomolecular dynamics have been visualized (e.g. protein-DNA structures) with nanometric resolution. Then a study about intracellular conformational changes of keratinocytes living cells in their physiological medium has been realized by acoustic microscopy SNFUH and show deterioration of biological components. All of these results provide new insights in biology field.DIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

Mesure des forces interparticulaires par microscopie à force atomique (application à la cohésion du ciment)

Cette thèse souligne l apport de la microscopie à force atomique, par son utilisation en tant que machine de force, dans l étude de la cohésion du ciment. Cette cohésion étant le fait de la présence d hydrate, l étude s est focalisée sur les hydrosilicates de calcium (C-S-H), phase hydrate majoritaire dans le ciment pris. L objectif de l étude était d identifier les forces d interaction entre nanoparticules de C-S-H. Pour cela, nous avons analysé les spécificités des C-S-H tant en terme morphologique qu en terme de réactivité vis à vis des solutions interstitielles pour en déduire les requis du système expérimental. Il ressort de cette étude la nécessité de faire croître une couche de nanoparticules de C-S-H sur des substrats porteurs et d assurer la mise à l équilibre des couches de C-S-H par rapport à la solution interstitielle. D autre part la rugosité de cette couche doit être minimale. Le système expérimental consiste en une pointe en nitrure de silicium et un substrat de calcite préalablement recouverts d une couche de C-S-H. Ces surfaces ont été mises à l équilibre dans différentes solutions interstitielles. La couverture sur la sonde est obtenu via une réaction en solution saturée d hydroxyde de calcium alors que le substrat de calcite est mis en réaction avec une solution d hydroxyde de sodium. Grâce à ce système expérimental, il a été possible de varier les solutions interstitielles et de mesurer l évolution des interactions inter C-S-H. Il ressort de l étude qu un puit attractif est présent et se renforce par la présence d ions divalent calcium et de forte densité surfacique de charge. La présence d ion monovalent sodium implique un puit principalement répulsif. Face à ce comportement, l hypothèse de l action de force de corrélation ionique a été émise.This thesis underlines the use of atomic force microscopy as force apparatus onto field of cement cohesion. As cement cohesion is triggered by hydrates, the study has been focused on Calcium Hydro-Sillicate (C-S-H), major part of hydrates. The scope of this study was to identify the acting forces between C-S-H nanoparticles. Particularities of C-S-H, concerning both its chemistry as well as its morphology, has been listed to built-in an experimental setup free of external influences like intrinsic roughness and reactivity of C-S-H. The experimental setup consists in the use of silicone nitride probe and calcite substrate previously covered by C-S-H nanoparticles. This experimental setup allows varying interstitial solutions while measuring force evolution accordingly. Results show that net attractive interaction is solely exhibit when calcium divalent ions and high surface charge density are involved whereas sodium monovalent ion triggers repulsive interactions. Within such behaviour, influence of ionic correlation force is suspected.DIJON-BU Sciences Economie (212312102) / SudocSudocFranceF

Etude fondamentale des mécanismes à l origine de la cohésion des nanoparticules de silicates de calcium hydratés par microscopie à force atomique

DIJON-BU Sciences Economie (212312102) / SudocSudocFranceF

De l'animal au parchemin : histoire, environnement, génétique

National audienceLe parchemin est une peau d’animal minutieusement préparée pour servir de support à l’écriture. Comment élabore-t-on un parchemin ? Qui sont les éleveurs de bétail, les parcheminiers au Moyen-Âge ? Vous le découvrirez grâce aux chartes, registres et partitions musicales exposés

Du parchemin à l’ADN : le dialogue entre les sciences historiques et les sciences du vivant

National audienc

Infrared nanospectroscopic mapping of DNA molecules on mica surface

Significant efforts have been done in last two decades to develop nanoscale spectroscopy techniques owning to their great potential for single-molecule structural detection and in addition, to resolve open questions in heterogeneous biological systems, such as protein-DNA complexes. Applying AFM-IR technique has become a powerful leverage for obtaining simultaneous absorption spectra with a nanoscale spatial resolution for studied proteins, however the IR-AFM investigation of DNA molecules on surface, as a benchmark for a nucleoprotein complexes nanocharacterization, has remained elusive. Herein, we demonstrate methodological approach for acquisition of IR-AFM mapping modalities with corresponding absorption spectra based on two different DNA deposition protocols on spermidine and Ni2+ pretreated mica surface. The nanoscale IR absorbance of distinctly formed DNA morphologies on mica are demonstrated through series of IR-AFM absorption maps with corresponding IR spectrum. Our results thus demonstrate the sensitivity of IR-AFM nanospectroscopy for a nucleic acid research with an open potential to be employed in further investigation of nucleoprotein complexes

Mécanismes d élaboration de la microstructure des bétons

L étude de l'hydratation de nos ciments modèles, composé d alite, de C3A, et de gypse, ont permis de quantifier les paramètres chimiques du rendement mécanique. Nous avons étudié l'interaction des processus de nucléation-croissance cristalline et de diffusion conduisant à l'élaboration de la microstructure des pâtes de ciment. Nous avons observé l évolution de la réaction d hydratation en fonction de paramètres (taille du gypse, grains anhydres polyphasé...), la mesure du rendement mécanique des hydrates, le gradient de concentration en ions dans la matrice, l étude des forces d interaction et des propriétés mécaniques des phases du ciment. Nous avons ainsi utilisé diverses techniques d analyse tel que la calorimétrie, DRX, ATG, MEB couplée à l analyse EDS, AFM et nanoindentation Nous avons développé une nanosonde de conductimétrie basée sur les techniques de microscopie à sonde locale de résolution nanométrique pour observer les gradients de diffusion à l échelle nanométrique.The hydration study of model cement, constituted of alite, C3A, gypsum, permit to quantify the chemical parameters of the mechanics hardening. We studied the interaction of nucleation-growth crystalline and diffusion processes to elaborate the microstructure of cement paste. We observed the evolution of the hydration reaction function of parameters (gypsum size, polyphased anhydrous grains ), the measurement of the mechanics of hydrates, the concentration gradient of ions in the matrix, the study of interaction force and the mechanics properties of the cement phase. We used almost techniques of analyse as calorimetry, DRX, ATG, MEB coupled with EDS analysis, AFM, and nanoindentation. We also developed a nanoprobe of conductimetry based on the local probe microscopy techniques of nanometric resolution to observe the diffusion gradient at nanometric scale.DIJON-BU Sciences Economie (212312102) / SudocSudocFranceF

Infrared nanospectroscopic imaging of DNA molecules on mica surface

International audienceAbstract Significant efforts have been done in last two decades to develop nanoscale spectroscopy techniques owning to their great potential for single-molecule structural detection and in addition, to resolve open questions in heterogeneous biological systems, such as protein–DNA complexes. Applying IR-AFM technique has become a powerful leverage for obtaining simultaneous absorption spectra with a nanoscale spatial resolution for studied proteins, however the AFM-IR investigation of DNA molecules on surface, as a benchmark for a nucleoprotein complexes nanocharacterization, has remained elusive. Herein, we demonstrate methodological approach for acquisition of AFM-IR mapping modalities with corresponding absorption spectra based on two different DNA deposition protocols on spermidine and Ni 2+ pretreated mica surface. The nanoscale IR absorbance of distinctly formed DNA morphologies on mica are demonstrated through series of AFM-IR absorption maps with corresponding IR spectrum. Our results thus demonstrate the sensitivity of AFM-IR nanospectroscopy for a nucleic acid research with an open potential to be employed in further investigation of nucleoprotein complexes

Intrinsic Elastic Properties of Calcium Silicate Hydrates by Nanoindentation

International audienceTo understand the mechanical properties of cement materials is obviously one of the main purposes of the material science. But the mechanical properties measures of a cement piece by conventional methods (vibration, compression, etc.) are largely dependent on the sample porosity. Hence, the result gives information about the sample density rather than on the intrinsic mechanical properties of the material itself. This work aims to present results on cement materials (alite and C-S-H) mechanical properties obtained by nanoindentation using an atomic force microscope (AFM). The material Young modulus in the z-direction is obtained by applying a force perpendicular to the sample surface using a diamond probe (spring constant = 40 kN/m). After checking the method with materials of known young modulus (mica, foshagite), results on compressed tricalcium (alite) samples will be presented for various hydration time, sample compressive strength and Ca/Si ratio. Then, nanoindentation results on calcium silicate hydrate (C-S-H) monocrystal will be shown. For C-S-H, the results exhibit Young modulus values increasing with the Ca/Si ratio and much greater as for porous alite samples especially for high Ca/Si ratio. All these results will be discussed and compared to theoretical and experimental works of the literature